疫情让 「mRNA 疫苗」 走向了大众的视野，相对于传统疫苗，mRNA 疫苗是将编码靶点特异性抗原的 mRNA 引入体内，利用宿主细胞的蛋白质合成机制产生抗原，从而触发免疫应答。没有传染能力，不能独立复制和装配；也不会整合到基因组中，故没有插入突变的风险，被普遍认为具有广泛的应用前景。 图1. mRNA疫苗作用原理[1] RNase H 介导加帽率测定方法的局限性 说到 mRNA 疫苗的工业化生产，目前较为高效方法的是体外转录技术 (IVT, In vitro transcription)。IVT 以线性 DNA 为模板，主要的工艺环节包括：线性化质粒 DNA 制备、线性化质粒 DNA 转录为 mRNA、5' 加帽结构 (Cap) 和 3' 加尾结构化学修饰、已修饰 mRNA 分离纯化以及纯化 mRNA 在体内的有效递送。作为 mRNA 疫苗生产的关键步骤之一，mRNA 加帽的适用的方法主要有两种：一种是使用帽结构类似物进行共转录加帽，另一种是单独使用加帽酶进行转录后加帽。无论是哪种加帽方法，反应的终产物中总是会存在一定量未加帽的 mRNA 分子。所以，加帽率的测定是一个非常关键又棘手的质控监测点。目前，工艺生产中常采用的加帽率测定方法是 RNase H 介导的探针切割法 [2]。该方法使用一段 2'-O-methyl 修饰的生物素标记 RNA 探针，可与底物 mRNA 5'UTR 区域发生互补配对，而 RNase H 会切割与探针 3' 末端切割位点配对的 mRNA 序列。之后，利用链霉亲和素磁珠分离得到 5' 切割产物，通过 LC-MS 定量分析帽子结构，计算出加帽效率。然而，由于 RNase H 切割位点并非专一，经常会产生一些额外的不同长度切割产物，影响到加帽率测定的可靠性。 图2. 体外转录(IVT)中mRNA的结构及常用的修饰策略[1] 新的核酶介导的加帽效率测定方法 近日，发表在 Pharmaceutics 杂志上题为 「Ribozyme Assays to Quantify the Capping Efficiency of In Vitro-Transcribed mRNA」 的一篇文章中，Katalin Karikó等设计了一种核酶介导的加帽效率测定方法，经过实验验证，其加帽效率测定方法优于传统方法 [3]。 研究人员设计出了在 mRNA 5'UTR 特定位点能够切割 mRNA 的核酶。在 IVT mRNA 中，核酶与 mRNA 5'UTR 特定位点发生退火结合，在镁离子存在下，核酶对 mRNA 5'UTR 的特定位点进行切割，切割产物的体系中包括有携带帽子结构的短 5' 切割产物、不携带帽子结构的短 5' 切割产物、未被切割的全长 mRNA、长 3' 切割产物以及核酶。同时，研究人员也同样设计了 RNase H 介导探针切割法对 IVT mRNA 进行了处理，其得到的切割产物包括携带帽结构的 5' 切割产物、不携带帽结构的 5' 切割产物、长 3' 切割产物、RNase H、未被切割的全长 mRNA 。 想要测定加帽率，就需要将 5' 切割产物从两种方法的酶切反应液中分离出来，那么又如何将 5' 切割产物进行纯化？研究者使用了 QIAGEN 基于硅胶模柱分级纯化方案，即 QIAGEN RNeasy Mini kit。该试剂盒中的硅胶模纯化柱可以在不同的缓冲液条件下，结合不同长度的 RNA 片段。首先，将 100μL 的酶反应液与 350μL 的 RLT 缓冲液和 250μL 的 100% 乙醇混合，并将混合液加载在纯化柱上。长片段 RNA，包括未被切割的全长 mRNA、长 3' 切割产物将会被留在纯化柱上，而短的 5' 切割产物将会随缓冲液流入下面的离心管中。接下来，向流出液 (700μL) 中加入 50μL 的 RLT 缓冲液和 500μL 的 100% 乙醇，将流出液加入到硅胶柱上后离心。此过程中，短的 5' 切割产物和核酶将会结合到纯化柱上（不同的缓冲液条件，RNeasy Mini kit 纯化柱可结合不同长度的 RNA 片段），经过 RPE 洗脱缓冲液的洗脱并离心及 100% 乙醇的洗涤并离心。最后，使用 30 μL RNase-free 的水将结合在纯化柱上的短的 5' 切割产物洗脱下来。最终，获得了 20 μg 的<5>5 kb 的 RNA 片段。最后，将硅胶柱纯化得到的短 5' 切割产物和核酶用 21% PAGE+ 8M 尿素或者 LC-MS 进行定量分析和可视化，得出不同方法的结果比较。 图3. 核酶介导的IVT mRNA切割的加帽率测定流程 在该项研究中，作者又通过优化核酶切割反应、评估不同长度 mRNA 的加帽效率得出结论：通过核酶介导的加帽效率测定方法，测定出酶法加帽的效率为 89 - 100%，CleanCap 共转录加帽效率 99%，而 ARCA 共转录加帽效率只有 34 - 77%。与 RNase H 介导的切割反应相比，核酶介导的切割反应显然具有极大的优势，切割位点单一，切割反应产物中不存在非特异性的条带。 参考文献： Wadhwa, et al. "Opportunities and Challenges in the Delivery of mRNA-Based Vaccines." Pharmaceutics 12.2(2020):102. Beverly, Michael, et al. "Label-free analysis of mRNA capping efficiency using RNase H probes and LC-MS." Analytical and Bioanalytical Chemistry 408.18(2016):5021 - 5030. Wadhwa, et al. "Opportunities and Challenges in the Delivery of mRNA-Based Vaccines." Pharmaceutics 12.2(2020):102.